DNr. 1.7
Bitki
doku kültüründe temel sistem, bir bitkinin yapay besin ortamında, bitkinin hücre, doku ve organlarının
klonlanmasıdır.
hücre: (meristematik
hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri),
organ: (apikal
meristem, kök vb.)
Bir
bitkinin bu kısımlarından yeni bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler
gibi) üretilmesidir.
Yeni
çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku
kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku
kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır.
Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin
üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır. Kültür türleri
Kültürü
yapılması istenen bitkinin özellikleri itibariyle üç kısımda incelenebilir;
1) Organize
olmuş meristematik hücreleri ihtiva eden somatik dokulardan rejenerasyon,
2) Meristematik
olmayan somatik hücrelerden rejenerasyon
3) Mayoz
bölünme geçirmiş gametlik hücrelerden rejenerasyon.
Birinci tip:
Rejenerasyonda, uç ve yan meristemlerden bitkiler
çoğaltılır. Buna Meristem kültürü yoluyla klonal çoğaltım denilir. Elde edilen
hücreler tamamen dönor (verici) bitkiye benzerler.
İkinci tip:
Rejenerasyonda, doğrudan bir bitkin eksplant denilen parçasının kesilmiş yüzeylerindeki belirli somatik
hücresinin, Besin ortamına ilave edilen bitki büyüme düzenleyicilerinin (özellikle
oksin ve sitokininler)`in etkisiyle bölünerek ve organize olarak, organları
ve daha sonra da bitkiyi (direkt organogenesis) veya bir somatik hücrenin
sürekli bölünerek embriyo ve daha sonra da tam bir bitkiyi oluşturması (direkt
somatik embriyogenesis) şeklinde olabilir.
Ayrıca
her iki durumda, belirli bir kallus, proto-kallus veya hücre süspansiyonu
oluşumu devresinden sonra da ortaya çıkabilir (in direkt rejenerasyon). Ortaya
çıkan bitkilerde bazı kalıtsal veya geçici varyasyonlar oluşabilir.
Son
olarak normal kromozom sayısının yarısını ihtiva eden hücrelerden de direkt
veya dolaylı yollarla bitki rejenerasyonu olabilir. Bu durumda donör bitkinin
kromozom sayısının yarısına sahip, genellikle steril olan haploid bitkiler elde
edilebilir. Bu bitkicik, doku veya hücrelerde kromozom katlaması yoluyla fertil
(dihaploid veya katlanmış haploit) bitkiler elde edilir.
Bitki doku kültürlerinin bitki ıslahındaki uygulama alanları
Türler
arası melezlemelerden sonra embriyo kültürü:
Zigot
oluşumundan sonra ortaya çıkan (post-zigotik) uyuşmazlıklar in vivo melezlemelerde
embriyo oluşumunu veya oluşan embriyoların yaşamalarını engellemektedir. Bu
embriyolar özel besin ortamlarında doku kültürü ile geliştirilmekte ve yeni
melez bitkiler elde edilebilmektedir. Bu tekniğe embriyo kurtarma tekniği denilmektedir
Haploid
bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü:
Özellikle
kendince döllenen bitkilerde yapılan klasik bitki ıslahı melezlemeleri sonrası,
hatların saflaştırılması (homozigotlaşması) uzun zaman almaktadır. Mayoz
bölünme geçirmiş haploid sayıda kromozoma sahip hücrelerde (polen/mikrospor
veya megaspor) veya bu hücreleri ihtiva eden bitki kısımlarının (anter veya
yumurtalık) doku kültürü yoluyla elde edilen hücrelerinde veya
rejenerantlarında yapılan kromozom katlanması sonucu %100 homozigot bitkiler
elde edilebilmektedir. Bu tekniğe in
vitro haploidi tekniği denir,
Somaklonal varyasyon:
Kallus
oluşturan veya totipotent olup yeni bitkiler meydana getirebilen hücreler uzun
süreli kültürlerde veya kısa süreli de olsa yüksek bitki büyüme düzenleyicileri
içeren ortamlarda bu yeteneklerini (kompotens) yitirebilmektedirler. Bu
hücrelerden oluşan yeni bitkilerde gen veya kromozom bozuklukları sonucu
kalıtsal ve fenotipik varyasyonlar (somaklonal varyasyon) ortaya çıkmaktadır.
Bu varyasyonlar, yeni çeşit geliştirme ve iyileştirmelerde ıslahçılar
tarafından kullanılmaktadır
Somaklonal
varyasyon sonucu ortaya çıkan değişiklikler arasında, bazı pigmentlerin
yapısındaki farklılaşmalar sonucu çiçek renginin, yaprak ve çiçek
morfolojisinin, tohum veriminin, bitki canlılığı ve iriliğinin, uçucu yağ
kompozisyonu ve hastalıklara tolerans veya dayanıklılığın değişmesi
sayılabilir.
İn vitro seleksiyon:
Tek
hücre seviyesinde; tuz, herbisitler, patojenler vb. faktörlere karşı
dayanıklılığa göre yapılan seleksiyonlar sonucu, bu hücrelerden elde edilen
bitkilerde ilgili faktörlere dayanıklı veya toleranslı bitkiler ortaya
çıkabilir. Bu tekniğe in vitro
seleksiyon denilmektedir.
İn
vitro döllenme:
Bazı
durumlarda (özellikle dış ortama alıştırılamayan bitkilerden tohum almak için)
doku kültürü ile elde edilen bitkiler laboratuvar şartlarında
tozlaştırılmaktadır. Fakat bu uygulama çok sınırlı kalmıştır.
İn vitro
germplazm muhafazası:
Totipotent
hücrelerin in vitro kültürü, kallus veya süspansiyon hücreleri şeklinde uzun
süreli olarak veya belirli aralıklarla yeniden oluşturularak saklanabilir ve
ihtiyaç duyulduğunda bu hücrelerden yeni bitkiler oluşturulabilir. Alternatif
olarak ilgili hücreler, meristemler veya elde edilen minyatür bitkiler düşük
sıcaklıkta (4 C°), çok az besin maddesine ve alana ihtiyaç göstererek aseptik
şartlarda (1-4 yıl) saklanabilir. Benzer şekilde çok düşük sıcaklıklarda -196
C°), sıvı azot içinde doku ve hücreler hızlı bir şekilde dondurulup
saklanabilirler. Bu doku kültürü teknikleri in vitro germplazm muhafazasında
önemlidir ve gen ve tohum bankalarına alternatif oluşturmaktadır.
Somatik hücre melezlemesi (protoplast
füzyonu):
Protoplast
füzyonu ve somatik melezleme, pre-zigotik eşeysel uyuşmazlıklar nedeniyle,
klasik melezleme ile elde edilemeyen hibritlerin elde edilmesinde kimyasal ve
fiziksel metotlar kullanılarak uygulanan bir tekniktir. Elde edilen somatik
melez hücreden (heterokaryon), kallus oluşumu ve bitki rejenerasyonu yoluyla
yeni bitkilerin elde edilmesi sistemin en önemli ve en gerekli parçasıdır. Bu
işlem genel anlamda genetik kopyalamadır ve bitkilerde yaklaşık 30 yıldan beri
uygulanmakta olup en başarılı örneği tütün bitkisinde görülmüştür.
Gen transferi:
Doku
kültürlerinin bitkileri iyileştirmede en önemli ve yaygın olarak kullanılan
uygulamalarından birisi de, gen veya genlerin bitkilere aktarılmasıdır. Bunun
için mutlaka tekrarlanabilir bir hücre-bitki rejenerasyonu (organogenesis ve
somatik embriyogenesis) sistemine ihtiyaç vardır.
Bitki doku kültürünün ticari ve ıslah
dışı uygulamaları
Hastalıksız bitki elde edilmesinde
meristem kültürü:
Tüm
apikal meristem veya buradan alınan küçük embriyonik parçalar kültüre alınarak
uygulanan tekniğe meristem kültürü
denir. Çok az miktarlarda bitki büyüme düzenleyicileri ilave edildiğinde uç ve
yan meristemlerden birçok yeni bitkicikler elde edilebilmektedir. Bu metotla
elde edilen bitkiler her bakımdan birbirinin benzeridirler..
Mikro çoğalım:
Organize
meristemlerden, henüz olgunlaşmamış veya olgunlaşmasını tamamlamış somatik
hücrelerden direkt (organogenesis veya somatik embriyogenesis) veya indirekt
(kallus, protoplast vb.) yollarla bitkilerin çoğaltılması ve köklendirilmesi
işlemine genel olarak mikro çoğaltım denilmektedir.
ABD'de
doku kültürünün ticari uygulaması 1970' de başlamış (orkidelerde ve süs
bitkilerinde) ve bu yolla elde edilen ürünlerin pazar değeri bu gün yılda 15
milyar dolara ulaşmıştır. Daha az sürgün elde edilmesine rağmen uç ve yan
meristemlerden kitle çoğaltım ticari olarak diğerlerinden daha fazla kullanılan
bir metottur.
Sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar):
Sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar):
Somatik
embriyoların çeşitli metotlarla kaplanması sonucu sentetik (yapay) tohumlar
elde edilmektedir. Sentetik tohumların, hibritlerin somatik çoğaltımında,
er kısır ve ebeveyn hatların muhafazasında ve odunsu bitkilerin elit
genotiplerinin elde tutulmasında kullanımı konusunda oldukça fazla çalışma
yapılmaktadır.
Sekonder metabolit üretimi
(kallus-hücre süspansiyonları):
İn
vitro hücre
kültürleri sekonder metabolit üretiminde de önemli bir kaynak olarak
görülmektedir. Bitki sekonder metabolitleri, bitki büyüme ve gelişmesinde
doğrudan kullanılmayan maddelerdir. Işık mikroskobu ile görülebilen sekonder
metabolitlerin (tanenler, antosiyaninler, keratenoitler) yanında UV ışığı ile
görülebilenleri (alkaloitler) de vardır. Son yıllarda sekonder metabolit
üretimi için ot verimi yüksek, çok yıllık, geniş adaptasyon kabiliyetine sahip
ve azotlu gübre kullanımı oldukça az olan yonca, alternatif bir bitki olarak
gösterilmektedir. İlgili enzim alındıktan sonra yoncanın geriye kalan kısmı ot
olarak kullanılabilir.
Kimeralar:
Doku
kültüründe, özellikle süs bitkilerinde üzerinde önemle durulan konulardan
birisi de kimeralardır. Kimerik bitkiler; farklı türlerin protoplastlarının
karışık kültürü ve bitki rejenerasyonu, mutasyon uygulamaları sonucu bitki
rejenerasyonu çalışmaları, apikal meristemle ilgili yapılan mikro-cerrahi
çalışmaları ve gen transferi yapılması sırasında, bir bitkiyi oluşturan bütün
hücrelerin ilgili gen veya genleri taşımaması durumlarında (özellikle partikül
bombardımanı metodu ve apikal meristemler kullanıldığında) elde
edilebilmektedir.
Bitki doku kültürlerinin temel araştırmalardaki uygulamaları
Doku
kültürü, protoplast izolasyonu ve füzyonu, hücre, doku ve bitki beslenmesi,
sitogenetik çalışmalar, morfogenesis çalışmaları ve biyolojik azot fiksasyonu
gibi temel araştırmalarda da kullanılmaktadır. Bu tür araştırmalar genellikle
sistem geliştirmede faydalı olmaktadır.
Doku kültüründe temel teknikler
Doku kültürü işlemleri bir çok aşamadan
oluşmaktadır. Bunlar:
1)
Uygun bir laboratuvar düzeninin
kurulması,
2)
Kullanılacak bitki parçalarının
(eksplant) ve besin ortamlarının seçimi, hazırlanması ve sterilizasyonu,
3)
Kallus ve hücre süspansiyonlarının
oluşturulması,
4)
Kallus veya hücre süspansiyonlarından
veya doğrudan somatik veya gametik hücrelerden bitki rejenerasyonunun
uyarılması (organogenesis, somatik embriyogenesis veya meristem çoğaltımı
yoluyla),
5)
Oluşan sürgünlerin çoğaltılması ve
boylarının uzatılması, somatik embriyoların olgunlaştırılması,
6)
Uzayan sürgünlerin köklendirilmesi,
7)
Köklenen bitkilerin dış ortama
alıştırılması (aklimatizasyon).
Bunlar arasında en önemlisi, uygun Laboratuvar imkanlarının sağlanmasıdır.
Doku Kültüründe en önemli konu steril işlemleri yapabilecek bazı temel alet ve ekipmanlara veya iyi bir laboratuvara sahip olmak gerekmektedir. Doku kültüründe en temel konular bitki parçaları ve kullanılacak alet ekipmanların iyice temizlenmesi sterilizasyonlar besin ortamlarının hazırlanması ve kültüre alınacak yerin belirlenmesidir.
Doku kültüründe bitkilerin değişik organlarından çok küçük parçacıklar steril koşullarda alınarak yeni bitkiler elde edilmesidir. Doku kültürünün Latince adı invitro’dur. İnvitro, yapay koşullarda tüpler içinde anlamına gelir. Bu yönteme doku kültürü denmesinin sebebi, yüksek olan tepe meristemi gibi bitki dokularının kullanılmasıdır.
Doku Kültüründe en önemli konu steril işlemleri yapabilecek bazı temel alet ve ekipmanlara veya iyi bir laboratuvara sahip olmak gerekmektedir. Doku kültüründe en temel konular bitki parçaları ve kullanılacak alet ekipmanların iyice temizlenmesi sterilizasyonlar besin ortamlarının hazırlanması ve kültüre alınacak yerin belirlenmesidir.
Doku kültüründe bitkilerin değişik organlarından çok küçük parçacıklar steril koşullarda alınarak yeni bitkiler elde edilmesidir. Doku kültürünün Latince adı invitro’dur. İnvitro, yapay koşullarda tüpler içinde anlamına gelir. Bu yönteme doku kültürü denmesinin sebebi, yüksek olan tepe meristemi gibi bitki dokularının kullanılmasıdır.
Doku kültüründe bazı zorluklar ve
sorunlarla karşılaşılabilir. Bunlar aşağıda belirtildiği gibi beş noktada
toplanabilir:
- Laboratuvar kuruluşu ve
laboratuvar malzemelerinin pahalılığı
- Kimyasal madde sağlamadaki
güçlükler
- Yetişmiş eleman sıkıntısı
- Çalışmanın fazla titizlik ve
sabır istemesi
- Bazı istenmeyen genetik
değişiklikler
Doku kültürü ile üretimde
mutlaka laboratuvara ihtiyaç vardır. Ülkemizde doku kültürü ile bitki
yetiştiren işletmelerin sayısı ve kapasiteleri yeterli olmadığından anaç
bitkiler yurt dışından ithal gelmekte, bu da büyük döviz kaybına yol
açmaktadır.
Bugüne kadar pek çok bitkide
invitro ile üretim başarılmış ve bu bitkilerin sayıları giderek artmaktadır.
Başarılı bir invitro üretimi için üç bölümden oluşan bir laboratuvar zorunludur.
Doku kültüründe kullanılan besin
ortamı, damıtık su içinde bulunan organik maddeler çözeltisidir. Bazı bitki
türleri hemen hemen her besin ortamında gelişebilir fakat bazı türler, özel
hazırlanmış besin ortamı gerektirir. Besin ortamı içeriklerinin farklı olması
sadece tür değişikliğine bağlı kalmaz. Aynı bitkinin farklı bitki kısımları da
faklı içerikli besin ortamı hazırlanması gerektirebilir, bu yüzden en uygun
besin ortamı, her üretimden önce deneme yapılarak saptanmalıdır.
TF-003
Bitkilerin iklimlendirme odasına alınması ve
köklü bitkilerin viyole alınması
Genel olarak besin ortamları
Makro ve mikro elementler,
organik karbon kaynakları, bitkisel hormonlar, vitaminler ve aminoasitlerden
oluşmaktadır. Besin ortamı, katı ve sıvı olarak kullanılabilir. Ortamın
katılaştırılması için agar eklenebilir. Steril koşullarda yetiştirilen küçük
bitkilerin normal kültürlerde kontrol edilmeleri zorunludur, çünkü steril
ortamda yetiştirilen küçük bitkiler, normal ortam şartlarına ve enfeksiyonlara
karşı hassastır. Bitkiler bir süre sera koşullarına alıştırıldıktan sonra
satışa çıkarabilir. Bu yöntemlerin kendilerine özgü bazı özellikleri olmasına
rağmen, hemen hepsinde kullanılan ve gerekli olan genel teknik aynıdır.
KAYNAK
Doç. Dr. Mehmet Babaoğlu
Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi, 42079 Kampüs, Konya
